慢病毒高效感染皮肤人永生化表皮细胞株HaCaT细胞的分化状态

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (29): 4625-4629.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.006

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慢病毒高效感染皮肤人永生化表皮细胞株HaCaT细胞的分化状态

侯娜¹，侯彬彬²，王秀丽³，刘玉芳¹，郭昕⁴，林茂²，许雪珠²

¹大连大学附属中山医院皮肤科，辽宁省大连市 116001；²大连医科大学附属第二医院皮肤科，辽宁省大连市 116027；³大连医科大学基础医学院，辽宁省大连市 116044；⁴中科院大连化学物理研究所生物技术部1802组，辽宁省大连市 116021

修回日期:2014-04-11 出版日期:2014-07-09 发布日期:2014-07-09
通讯作者: 许雪珠，博士，教授，主任医师，硕士生导师，大连医科大学附属第二医院皮肤科，辽宁省大连市 116027
作者简介:侯娜，女，1982年生，河北省永年县人，汉族，2014年大连大学毕业，硕士，医师，主要从事皮肤肿瘤外科方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81171489)

Differentiation of HaCaT cells infected with lentivirus

Hou Na¹, Hou Bin-bin², Wang Xiu-li³, Liu Yu-fang¹, Guo Xin⁴, Lin Mao², Xu Xue-zhu²

¹Department of Dermatology, Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China; ²Department of Dermatology, Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, Liaoning Province, China; ³College of Basic Medical Science, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; ⁴Group 1802, Department of Biotechnology, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116021, Liaoning Province, China

Revised:2014-04-11 Online:2014-07-09 Published:2014-07-09
Contact: Xu Xue-zhu, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Dermatology, Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, Liaoning Province, China
About author:Hou Na, Master, Physician, Department of Dermatology, Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171489

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实YY1主要在小鼠基底层未分化表皮细胞中表达，且随着表皮细胞向基底上层分化其表达逐渐下降，这种差异性表达方式说明YY1可能是表皮细胞分化过程中重要的调节因子之一。

目的：采用慢病毒-YY1感染HaCaT细胞观察YY1过表达对细胞分化的影响。

方法：将慢病毒-YY1感染至HaCaT细胞，经puromycin筛选，建立单克隆稳定细胞株，设对照组为慢病毒感染的HaCaT细胞和未感染的HaCaT细胞，Western blot检测分析YY1蛋白的表达水平；将慢病毒-YY1-HaCaT组和HaCaT-YY1组细胞各分成2组，一组在低钙(0.12 mmol/L)培养基条件下培养48 h，另一组在低钙 (0.12 mmol/L)培养基条件下培养24 h后在高钙(0.35 mmol/L)培养基条件下再培养24 h，用Western blot法检测YY1过表达对HaCaT细胞分化中的表皮细胞特异性分化角蛋白K1、K10、K14和晚期分化产物外皮蛋白、中间丝相关蛋白、兜甲蛋白的影响。

结果与结论：慢病毒-YY1成功感染HaCaT细胞，高钙条件下获得的单克隆细胞株过表达YY1蛋白，可抑制K1、外皮蛋白和兜甲蛋白的合成，从而阻止表皮细胞角质化进程并使细胞处于未分化状态。结果说明慢病毒可高效感染皮肤人永生化表皮细胞株HaCaT细胞，YY1可能是抑制基底表皮细胞分化并维持其未分化增殖状态的重要因子之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, HaCaT细胞, YY1, 慢病毒, 角蛋白, 感染, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: YY1 is mainly expressed in the undifferentiated epidermic cells in mouse basal lamina, and the expression level is gradually down-regulated as the differentiation towards suprabasal lamina. The differential expression indicates that, YY1 is one of the regulators in the process of epidermic cells differentiation.

OBJECTIVE: To observe the effects of YY1 over-expression on the differentiation of HaCaT cells infected with lentivirus.

METHODS: Lentivirus-YY1 was transferred into the HaCaT cells by using Lipofectamine 2000. After selection of the puromycin, monoclonal cell lines were established, and the control group were lentivirus-infected HaCaT cells and uninfected HaCaT cells. The expression of YY1 was detected by using western blot analysis. Cells in Lentivirus-YY1-HaCaT group and HaCaT-YY1 group were further divided into two subgroups according to the calcium concentration in culture medium, cells were either cultured in low-calcium medium (0.12 mmol/L) for

48 hours, or cultured in low-calcium medium (0.12 mmol/L) for 24 hours and in high-calcium medium (0.35 mmol/L) for additional 24 hours. Keratin K1, K10, K14, and involucrin, filaggrin and loricrin after over-expression of YY1 were detected with western blot analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: The HaCaT cells were successfully infected with lentivirus-YY1, and we obtained over-expression of YY1 protein in monoclonal cell lines under high-calcium concentrations, the over-expressed YY1 could decrease the expression of K1, involucrin and loricrin, thereby preventing the process of epidermal keratinocytes and maintaining the cells in an undifferentiated state. Lentivirus can efficiently infect human immortalized epidermal cell HaCaT, and YY1 may the important factor of inhibiting the differentiation of basal epidermal cells and maintaining the undifferentiated proliferation status.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: lentivirus infections, YY1 transcription factor, keratin

中图分类号:

R318

侯娜，侯彬彬，王秀丽，刘玉芳，郭昕，林茂，许雪珠. 慢病毒高效感染皮肤人永生化表皮细胞株HaCaT细胞的分化状态[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(29): 4625-4629.

Hou Na, Hou Bin-bin, Wang Xiu-li, Liu Yu-fang, Guo Xin, Lin Mao, Xu Xue-zhu. Differentiation of HaCaT cells infected with lentivirus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4625-4629.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

表皮是皮肤的浅层结构，主要由复层扁平上皮构成，以28 d为周期进行自我更新。角质层位于表皮的最浅层，由几层到几十层扁平无核角质细胞组成，是表皮的主要构成细胞(占95%以上)，也是皮肤更新及发挥屏障和免疫作用的主要功能性细胞之一，在维持皮肤的正常生理功能中起着非常重要的作用^[1]。分化过程中产生的角蛋白是角质形成细胞的重要组成部分^[2]，因此角质形成细胞可成为基因治疗的重要载体^[3]。

HaCaT细胞是人永生化表皮细胞株，因其具有活性好、存活率高、实验成果特征明显等优点现已成为学者们研究人表皮细胞的重要靶细胞。慢病毒载体是以HIV(人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展的基因治疗反转录病毒载体，该载体可将外源基因有效地整合到宿主细胞染色体上，以补偿基因缺陷或抑制异常表达的基因并获得持久性表达从而达到治疗肿瘤及多种疾病的目的^[4]，具有广阔的应用前景。

Xu等^[5]研究发现，正常皮肤表皮基底层中未分化表皮细胞表达特异性分化角蛋白K5及K14，到棘层时主要表达K1和K10^[6]，至颗粒层后又开始表达晚期分化产物如中间丝相关蛋白^[7-8]、兜甲蛋白及外皮蛋白^[9]。

YY1(Yin-Yang1)属于锌指类转录因子GL1-Krüppel家族，也属于多梳蛋白家族(polycomb protein group，PcG)^[10-11]，是广泛地存在于人和动物细胞核内的转录调控因子^[12]，它既可以作为阻遏因子，又可作为转录激活因子发挥作用^[13]。

研究证实YY1主要在小鼠基底层未分化表皮细胞中表达，且随着表皮细胞向基底上层分化其表达逐渐下降，这种差异性表达方式说明YY1可能是表皮细胞分化过程中重要的调节因子之一^[4]。也有报道证实YY1在多种肿瘤中高表达，且表达水平与患者预后成正相关。因此，降低肿瘤细胞中YY1的活性及其表达水平有望成为YY1靶向治疗的首要途径。为了使基因治疗更广泛的应用于皮肤病领域，文章采用慢病毒-YY1感染人永生化表皮细胞株HaCaT细胞，获取单克隆稳定细胞株，研究YY1过表达对细胞分化的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：实验于2012年11月至2013年10月在大连医科大学附属第二医院中心实验室、大连化学物理研究所和上海吉凯公司实验室完成。

材料：

实验方法：

HaCaT细胞培养：复苏细胞，待细胞达到70%-80%融合后，加入胰酶，待大部分附壁的HaCaT细胞悬浮，立即加入等量含体积分数10%的胎牛血清和1%青链霉素溶液的DMEM培养基终止消化，离心弃上清，加入培养液重悬细胞，按1∶4的比例接种于25 mL培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，两三天换液1次，选择生长旺盛、状态良好且处于对数生长期的细胞用于后续实验。

实验分组：慢病毒-YY1感染HaCaT细胞组、慢病毒感染的HaCaT细胞组和未感染HaCaT细胞组。

感染HaCaT细胞：病毒感染前24 h用胰酶消化处于对数生长期的HaCaT细胞，含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心弃上清，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴)，分入12孔培养板中培养，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养过夜，待细胞融合度达到约20%时开始感染。依据Lipofectamine 2000使用说明操作，感染当天按实验设计的组别根据细胞MOI值，加入适宜量的病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。12 h后如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养至16 h更换培养基；当细胞增长接近汇合时按1∶4比例传代继续培养，待细胞融合至70%-80%时以终浓度1.00 mg/L的puromycin(嘌呤霉素)进行筛选，根据培养基的颜色和细胞的生长情况每3-5 d更换1次筛选培养基，当有细胞大量死亡时，可以将puromycin浓度减半维持筛选，连续筛选14 d后，正常HaCaT细胞全部死亡，可见有puromycin抗性的细胞出现，停药培养，待细胞逐渐增大置于96孔板中继续培养2周后，挑取单克隆(慢病毒-YY1-HaCaT组和HaCaT-YY1组已形成细胞克隆)，最后细胞大量扩增抽提总蛋白进行Western blot检测。

Western blot检测慢病毒-YY1-HaCaT细胞中YY1蛋白的表达：实验组为慢病毒-YY1感染HaCaT细胞，对照组为慢病毒感染的HaCaT细胞，每个样品蛋白终浓度均调整为2 g/L，上样量均为20 μg。采用分离胶10%进行SDS-PAGE电泳，在4 ℃，300 mA恒流条件下湿转 150 min，将蛋白转移到PVDF膜上。用封闭液室温封闭PVDF膜1 h或4 ℃过夜，一抗室温孵育2 h或4 ℃过夜。洗膜后二抗室温孵育2 h，采用Amersham公司ECL+plus^TM Western blotting system试剂盒进行显色，获得显示条带的胶片。

两种条件下的HaCaT细胞培养：据报道，Ca²培养基浓度的高低对表皮细胞的分化有重要影响。将慢病毒-YY1感染HaCaT细胞组和慢病毒感染的HaCaT细胞组各分成2组，一组在低钙(0.12 mmol/L)培养液培养48 h，另一组在低钙环境下培养24 h后在高钙(0.35 mmol/L)条件下再培养24 h，用Western blot法检测YY1过表达对HaCaT细胞中的表皮特异性分化角蛋白K1、K10、K14、外皮蛋白、中间丝相关蛋白和兜甲蛋白的影响。

主要观察指标：①慢病毒-YY1感染HaCaT细胞是否成功。②YY1过表达对表皮细胞特异性分化角蛋白表达的影响。

统计学分析：Western blot的差异蛋白分析采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，以慢病毒-YY1感染HaCaT细胞组和慢病毒感染HaCaT细胞组的灰度值比值进行配对t 检验，差异可信区间为95%，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

慢病毒载体感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，它能够整合到宿主细胞的基因组，感染分裂期和非分裂期细胞(如肝细胞，神经细胞，造血干细胞，甚至原代细胞)，实现目的基因在体内较长期的稳定表达，具有感染效率高、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应低、安全性高等特点^[14-15]，且在活体实验时也不易发生非特异性反应^[16]。

目前研究发现，脂质体感染法、阳离子多聚物感染法和电穿孔联合细胞核感染试剂感染法都较慢病毒载体感染效率低，因此慢病毒成为基因治疗的首选载体。本实验中采用慢病毒作为感染载体，但经预实验得出包装的慢病毒滴度在2×10⁸ TU/mL即感染复数MOI值是20时，感染效率不甚理想，后考虑加入Polybrene多聚阳离子试剂(可以中和病毒颗粒与细胞表面所携带的负电荷，在大部分细胞中可以有效地提高感染效率)和Enhanced Infection Solution(Eni.S)感染增强液^[17]，结果感染效率可达到80%，完全可以满足后续实验的要求，且随着病毒滴度的增高，感染效率也不断增高。

YY1属于转录因子GLI-Krǔppel家族，有证据显示YY1是一个多功能的转录调节因子，具有起始、激活和抑制的作用^[18]。YY1不仅与胚胎发育、染色质重塑、细胞周期调控、细胞组织分化、抑制细胞凋亡方面有相关性，而且还参与病毒感染、B细胞发育、X染色体失活、基因印迹以及肿瘤形成等多种基本生物学过程。YY1不仅对肿瘤的形成具有促进作用^[19]，且与癌基因、抑癌基因、血管生成相关因子和抗细胞凋亡途径密切相关^[20]，其还可促进正常细胞的增殖，且其表达与细胞生长速度呈负相关^[21-22]。
Xu等^[5]研究发现YY1蛋白过表达于未分化的基底表皮细胞内并随着细胞向基底上层分化逐渐下降，在肌原细胞分化过程中钙激活蛋白酶Ⅱ和26S蛋白酶体可下调YY1蛋白的表达^[23]，表皮细胞分化过程中细胞内钙水平升高，钙依赖性转录后蛋白水解机制可能是表皮细胞分化过程中YY1特异性失活的重要原因之一。

目前相关报道多为慢病毒直接感染HaCaT细胞(未携带外源基因)，且技术成熟，而本实验则通过慢病毒载体携带外源基因YY1感染到HaCaT细胞染色体过表达YY1，发现细胞状态良好并可持续稳定表达，说明YY1可以作为基因治疗皮肤肿瘤和其他疾病的靶点并进行进一步的研究。

本实验采用慢病毒载体携带YY1基因感染的人永生化表皮细胞株HaCaT细胞，发现YY1过表达可负调控表皮细胞特异性分化角蛋白K1、外皮蛋白和兜甲蛋白，抑制细胞分化并维持表皮细胞的未分化状态，使本研究为YY1蛋白可能是抑制基底表皮细胞分化并维持其未分化增殖状态的重要因子提供了一定的实验依据，但YY1是一种多功能调节因子，它是否也会激活表皮其他因子从而对表皮细胞的分化有一定的促进作用，还需进行更进一步的相关研究。

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